分类目录归档:核磁实验

关于核磁实验的一些介绍内容

1D-选择性NOESY

由于NOE信号增强很弱,因此NOESY常常需要扫描很长的时间(数小时到数天不等)。而通常情况是,实验人员并不需要得到整个结构的NOE关系,往往几个关键H之间的距离远近就足以对化合物结构做出一个准确的判断。在这种情况下,1D-选择性NOESY可以通过有目的地照射目标峰来快速得到需要的信息。

为了保持一致,这一实验的混合时间仍然定在1.0 s,选择性脉冲照射在了甲基的H上。在相同的扫描次数下,1D仅需要2D实验1/256的时间,却在H14上得到了和二维实验相同的结果。如果化合物浓度很低,那么节省下来的时间又可以成倍地用在增加扫描次数来提高信噪比上。事实上,在实际应用中,我更倾向于使用NOESY实验的1D版本。

需要注意的是,正负信号都有可能在空间上与照射峰接近,具体原因参见NOESY中正负峰的分析。

一维选择性TOCSY

作为TOCSY的1D版本,这一实验能在很短的时间内,通过选择性脉冲,观测到与激发峰相关的H-H远程耦合信号。

如图所示,红色箭头所标示的是选择性激发的核,随着自旋锁定下接力相干传递,相关峰在谱图上以正相位显现出来。在混合时间相同的情况下,实验结果与2D实验一致。需要注意的是,当激发的H与相邻峰靠的比较近时,需要调节选择性脉冲的激发范围来避免“误伤”。

1D实验极大地缩短了实验时间(尤其在之后要提到的NOESY中),专一地提高了感兴趣信号的信噪比(与2D相比,NS可以设的很大),在不需要得到结构所有相关信号的情况下发挥着比其2D版本更为实用的作用。

氘谱(DNMR)

14N相比,氘的核四极效应要小的多,从而能被核磁检测到。不过由于大部分核磁以D核作为锁场匀场观测核,因此采集D谱通常只能在脱锁状态下进行(有些专门做D谱的仪器则以F来锁场)。上图为我在脱锁状态下做的氘谱,2.5的单峰是氘代DMSO的甲基峰,核四极作用对峰型宽度影响不大。从图中可以看到,氘谱中D出峰的化学位移值与H几乎相同。

常见杂核谱(FNMR,PNMR,SiNMR)

19F,31P以及29Si均为在核磁中做的比较多的杂核。与1H及13C一样,这类核在核磁共振检测中有一个很明显的优势——均为1/2核,因此谱图线型好,便于分析。通常杂核谱都对H核去耦而去除了H的耦合信息(类比于C13CPD),而通过化学位移来判断结构。由于我们的“单一化合物”并没有这三种核,因此我临时做了三张其他化合物的谱图来做一个简单说明。

氟谱(FNMR)

19F的核磁灵敏度与1H核相近,一般出峰范围在100—负300 ppm之间,通常用CF3Cl来标定0点,也可以用CF3COOH的-78.5 ppm来做标定。通常可以做F谱来判断化合物中是否含有F元素。

磷谱(PNMR)

31P的灵敏度强于13C但弱于19F,但一般在较短的扫描时间内也能得到较为满意的谱图。谱图出峰集中在230—负200 ppm范围,通常用H3PO4标定0点。

硅谱(SiNMR)

29Si灵敏度与13C接近,但是由于其旋磁比为负因此弛豫期间对H照射产生的NOE效应并不利于信号增强(甚至还会减弱)。核磁管玻璃中的29Si信号通常会对谱图产生干扰,因此需要核磁人员小心地进行基线处理扣除背景信号。29Si谱的出峰集中在100—负400,和大部分氢谱一样,TMS作为0点的标定。

总体而言,这三种1/2核是核磁常做的3种杂核,通常可以利用核磁来做一个快速的判断。而15N由于灵敏度太低通常需要同位素标记或富集后长时间扫描得到,之前提及的反向检测技术(见H-N HSQC/HMBC)在应对周围连有1H的15N核有特效。

C溶剂峰压制

Bruker官方给出的标准脉冲中并没有碳溶剂峰压制实验,所以我自己编了一个碳溶剂压制脉冲,依然是拿我们的“标准化合物”下手。不过这一实验在我们高浓度的样品峰下除了能让谱图看起来更加直观,并没有任何效果。但是可以预计,在稀浓度的样品中,这一实验将会有它的用武之地。

H溶剂峰压制

溶剂峰压制在核磁中是一个很重要的技术,尤其在做生物大分子或者LC-NMR联用时,溶剂信号甚至会是样品信号的10万倍,由于计算机的采样位数是固定的,大量的溶剂信号会几乎占满计算机的动态范围,而只留下很少的位数用来描述夹杂在噪音峰中的目标峰。上图中是回收乙腈的核磁谱图,在溶剂压制之前,几乎只能看到乙腈和水的信号;而在压制了两个溶剂峰之后,回收溶剂中的杂质峰渐渐显现。

F去耦氢谱

与H同核去耦谱相比,F去耦氢谱显得更为实用一些。

由于之前的化合物没有F核,因此在杂核实验中我会临时选用一些新的化合物。熟悉核磁的人都知道,除了1H核外,19F和31P都是较为灵敏的1/2核。尤其是19F,其在自然界100%的丰度以及极为接近1H的旋磁比,使得其在核磁中如H谱一样容易得到,但同时带来了一个问题:F对于H谱造成的影响也不可小视。而与H核的相互耦合不同,F对于H的耦合常数即使相隔多键仍然很大,这就导致了含氟化合物的谱图十分复杂,而当有多个F原子时,即使简单的结构也变得难以辨认。如本例的结构,在未对F去耦前较难对H进行归属,但去耦之后H之间的耦合关系一目了然。

H同核去耦谱

与C13CPD对氢的全去耦不同,H同核去耦谱通过照射某个很窄频率的H信号,起到将原先耦合的复杂峰变得单纯化的作用。为了便于讨论,我将上图6.4-7.6 ppm的谱图放大。

通过之前的H谱及J-分辨谱分析我们已经知道,这个范围内的4个峰从做往右依次是H6,H2,H9以及H7。其中H7与H6的J3耦合较大(8.8 Hz),从而使H6呈现d峰;H9与H7较小的J4耦合(2.4 Hz)使H9呈现d峰;H7同时受到H6和H9的耦合形成如图所示的dd峰。而同核去耦通过照射某个H,使得此H核在短时间内在两种自旋状态中快速变化,以至于相邻的核无法观察到其所处自旋状态,因此达到去耦的目的。

图中红色箭头标示的是照射的H核位置。谱一为普通H谱;谱二通过照射H6,去除了H6对H7的J3耦合,使dd峰型的H7变为d峰;谱三对于H9的照射同样去除了H9对H7的耦合作用。这一结果相对于二维谱快速而直接,对于简化谱图和指认结构耦合关系有一定的作用。不过缺点在于照射的峰必须独立,否则容易“眉毛胡子一把抓”。总体而言,实用性不是太大。

DEPT135

由于之后还要针对这个化合物做各种二维实验,因此碳谱的归属是必须要做的。与氢谱想比,由于C13的丰度小,以及碳本身的旋磁比仅为H核的1/4,因此做碳谱需要比氢谱花更多的时间。很多氢谱扫描一次信噪比已经很好,但相同浓度的碳谱要得到同样的信噪比却需要数千次的扫描——即意味着数千倍的时间,因此很多合成人员的碳谱都被安排在晚上过夜。而事实上,很多情况下在得到氢谱的数据后,如果需要加做碳谱往往只是解谱人员对某些基团的不确定,当这些基团不是季碳的时候,有一种碳谱能够在1/3的时间内得到比普通碳谱更好的结果——DEPT!

DEPT是Distortion Enhancement by Polarization Transfer的缩写,翻译成中文就是无畸变极化转移增强。其碳信号增强原理与大名鼎鼎的INEPT相似,但是较后者有更多的优点,原理我就不多说了,在氢谱不能给出满意答案不得不求助于碳谱的信息时,我会习惯先做一个DEPT135!

上图即是这一结构的DEPT135的谱图,我们可以看到有正和负两种相位,这正是DEPT135的奇妙之处!它能够让CH3和CH信号为正,CH2信号为负,而不与氢相连的季碳不出信号!(即所谓的奇正偶负)由于普通碳谱对氢去耦后不像氢谱能观察到相邻基团的耦合信息,对于碳谱的解读很多时候只能靠数碳的个数和看化学位移来大致判断,当化合物结构很复杂时,对于碳的归属往往让人一筹莫展。但DEPT135能在更短的时间内帮我们把这些信号分类:去除掉季碳信号;将碳信号按照正负排列;更别说还能大幅度减少实验时间——何乐而不为呢。几乎只瞄了一眼这图我们就可以清晰认出,43和30 ppm的两个负峰为亚甲基的碳,55.8 ppm的那个峰为与氧相连的甲基碳,低场的4个峰为环上的4个CH。

不过对于解谱人员有一点需要了解的是,拿到手的谱图相位有可能是反的。因为在输入相位校正命令的时候软件自动将最高的峰定义为正,有时候当CH2的信号最强时,往往会被校正为正峰。对于软件而言,正负只是相对的。如果出现了谱图中碳信号与预想中正负完全相反时,可以要求核磁人员将信号校正过来。

此外,DEPT谱还有另外两种常见的形式,分别是DEPT45和DEPT90。与DEPT135一样,所有DEPT实验都没有季碳信号。(这里要注意,与碳谱不同,理论上氘代溶剂DEPT应该不出峰。但是实际上有时候能够在DEPT谱上看到较弱的溶剂信号。这一信号可以对应碳谱的溶剂出峰位置予以排除)但是,区别在于DEPT45中所有CH,CH2,CH3均为正峰,而DEPT90中我们理论上仅能看到CH信号。在DEPT家族中,DEPT135给出的信息显然最多,因此一般做135即可。而与另外两种实验结果线性组合可以给出CH,CH2,CH3三种信号的三个独立子谱。

为了让帖子更为完整,今天补充做了DEPT90和DEPT45的谱图如下,方便大家与DEPT135进行区别。可以看到,在DEPT90的谱图上还是可以看到残留的季碳信号的,这是由于90度H脉冲与实际值偏差导致,可以通过调节仪器的P3时间来优化谱图。

DEPT90

DEPT45

定量碳谱

经常有合成人员想要和H谱一样对C谱积分——这并非完全错误,一些化学环境相近的C的确可以积分(如长链烷烃中间部分的C),但对于大部分C来说,NOE效应及弛豫时间的较大差异使得普通碳谱无法做出定量的判断(详见之前C13CPD的讨论)。但是一种被称为“反转门控去耦”的脉冲通过在等待期关闭H去耦来减小NOE效应,并延长弛豫恢复时间来达到碳谱定量的目的。

平心而论,图中C13CPD中的定量效果并不差,但是由于季碳没有与氢相连而产生的NOE增益,在积分中数值偏小,而与之相比,下面等待时间设为60s的定量碳谱给出了令人满意的结果。

然而弛豫回复时间的取值在定量碳谱中是一个需要权衡的问题:理论上越长的恢复时间结果越准确,但是碳谱动辄上千次的累加次数使得大取值会极大增加扫描时间,因此定量碳谱会是一个让所有做谱人员头疼的问题。好在碳谱对于分辨率要求不是太高,很多时候可以通过加入弛豫试剂加速碳弛豫时间来达到缩短实验时间的目的。